Техника микроскопирования при среднем увеличении

Основные сведения

Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.

¨ Задание:

1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Таблица 2

Методы и техника микроскопирования

1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).

Различают:

Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .

в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.

г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.

д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.

е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.

3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.

Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.

С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.

Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.

Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.

В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.

Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.

Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.

Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.

А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.

3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.

Таблица 3

Препараты тканей с разным окрашиванием

Микроскопическая техника - это комплекс приемов и правил обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными частями.

При работе с микроскопом прежде всего необходимо оберегать его от загрязнений (в промежутках между работой его накрывают стеклянным или картонным колпаком). Не рекомендуется часто вывинчивать объективы: срабатывается резьба и нарушается их центровка. Оптическую часть тщательно протирают много раз стиранной незагрязненной батистовой или полотняной тряпочкой, следы грязи удаляют тампоном, смоченным 95% спиртом, а затем протирают сухим тампоном. Масло снимают с поверхности линзы сухой мягкой тряпкой, а его остатки можно удалять ксилолом. С механической части прибора удаляют . Сложная чистка и смазка производится специалистом.

Работа с современными микроскопами требует применения рационального освещения, тщательного выбора оптической системы «объектив - окуляр - конденсор», а также предметных и покровных стекол необходимого качества, соответствующей подготовки препарата - объекта исследования. В качестве точечных источников света служат осветители ОИ-7, ОИ-9, ОИ-18, ОИ-19, снабженные коллекторной линзой. Осветитель устанавливают на расстоянии 30-40 см перед микроскопом. Не следует слишком ярко освещать , так как это снижает качество изображения. Установив освещение, регулируют угловую апертуру конденсора, открыв полностью апертурную диафрагму и закрыв полностью диафрагму поля (коллектора), наблюдают в микроскоп светящийся кружок (отверстие диафрагмы). Затем постепенно суживают апертурную диафрагму до момента, когда в поле зрения будет видно пятно без голубой или зеленой каймы. Качество изображения зависит от рационального применения объективов и окуляров. Пользуясь различными сочетаниями объективов и окуляров, можно получить различные увеличения. Однако выбор нужного увеличения должен определяться прежде всего объектом, целями исследования и разрешающей способностью микроскопа.

При бактериоскопии, как правило, применяются иммерсионные объективы (масляный, водный, глицериновый). Для получения хорошего изображения без применения покровного стекла рекомендуется употреблять специальное иммерсионное масло, каплю которого наносят на мазок, расположенный на предметном стекле. При работе с иммерсионным объективом нужно очень осторожно опускать тубус, чтобы не повредить фронтальную линзу объектива. Качество изображения зависит и от толщины предметного стекла (не больше 1,1-1,4 мм) и покровного стеклышка (не толще 0,15-0,17 мм).

Вспомогательными приборами при микроскопии служат: нагревательный столик, окуляр-микрометр, объект-микрометр, рисовальный аппарат и микроманипулятор.

Нагревательный столик устанавливается вместо предметного стола. Степень нагрева регулируется терморегулятором. Препарат на таком столике устанавливается, как и на обычном предметном столике микроскопа.

Окуляр-микрометр дает возможность измерения наблюдаемых объектов. С этой целью фокусируют объектив на шкале объект-микрометра, каждое деление которого равно 10 мк.

Важным разделом микроскопической техники является зарисовка объекта исследования. Рисунок можно сделать визуально или более точно при помощи рисовального аппарата. При визуальном методе в микроскоп смотрят левым глазом, а правым следят за движением карандаша на бумаге. Рисовальный аппарат насаживается на тубус микроскопа. Зеркало отбрасывает через призму изображение бумаги и карандаша, рисующего в плоскости глазной точки окуляра, в глаз, поэтому наблюдатель одновременно видит объект, бумагу и кончик карандаша.

Микроманипулятор позволяет осуществлять тонкие и точные движения микроинструментов и выполнять в поле микроскопа некоторые операции на клетке (удаление и ядер, инъекции различных веществ, отрезание различных участков и т. д.). Он состоит из системы штативов, снабженных винтами, зажимающими микроинструменты, что обеспечивает движение микроинструментов во всех направлениях.

Живые объекты () помещают на предметное стекло в каплю наиболее подходящей для них среды (можно изотонический раствор хлорида натрия) и, накрыв покровным стеклом (), рассматривают в проходящем свете в светлом или темном поле. Фиксированные и окрашенные препараты бактерий изготовляют в виде мазков или отпечатков (см. Окраска микроорганизмов).

Микроскопирование препаратов - см. Микроскопия. См. также Микроскоп.

Микроскопическая техника - правила обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными приборами.

Важное условие успеха микроскопирования - установка освещения. Только при оптимальном освещении по Келеру (рис. 1) можно реализовать все возможности микроскопа. Чтобы установить освещение по Келеру, необходимо иметь стандартный осветитель типа ОИ-7 (рис. 2) или ОИ-19 с микролампой (с небольшой, плотно скрученной спиралью), которую можно передвигать вдоль оси осветителя. При этом свет микролампы фокусируется линзой-коллектором, и на некотором расстоянии от осветителя возникает резкое изображение спирали лампы. Площадь линзы ограничивается ирис-диафрагмой переменной величины. Резкое изображение спирали лампы направляют через зеркало микроскопа на закрытую до отказа диафрагму конденсора, представляющего светосильную короткофокусную систему линз, которая собирает весь входящий в нее световой поток на очень малый участок объекта. Весь осветитель перемещают по столу до тех пор, пока изображение спирали лампы не покроет всю диафрагму конденсора. Этот момент замечают, глядя спереди на плоское зеркало микроскопа, в котором отражается диафрагма конденсора. Если нужно, лампу в осветителе передвигают вдоль оси, пока изображение спирали не достигнет нужной величины, после чего полностью открывают диафрагму конденсора.

Рис. 1. Схематическое изображение хода лучей при освещении препарата по методу Келера: 1 - нить лампы; 2 - коллектор; 3 - диафрагма поля; 4 - изображение нити лампы в плоскости апертурной диафрагмы; 5 - апертурная диафрагма; в - конденсор; 7 - изображение краев диафрагмы поля в плоскости препарата.

Рис. 2. Микроскоп МВИ-1 с осветителем ОИ-7.

Затем на предметный столик микроскопа ставят препарат и фокусируют на нем тот объектив, с которым собираются работать.

Глядя в окуляр, движением плоского зеркала добиваются наилучшего в этих условиях освещения. Затем закрывают до упора диафрагму осветителя. Если при этом ее изображение уходит из поля зрения, его нужно вернуть движением зеркала. Поднимая или опуская конденсор, стараются сделать изображение диафрагмы осветителя резким. Этим определяется оптимальная высота конденсора при его взаимодействии с данным объективом (при работе с объективами малых увеличений приходится отвинчивать верхнюю линзу конденсора, чтобы согласовать его работу с возможностями объектива). При смене объектива изображение закрытой диафрагмы осветителя следует снова сфокусировать в фокальной плоскости объектива.

Движением зеркала изображение диафрагмы осветителя переводят в центр поля зрения. Если края изображения окрашены неодинаково (один полюс синеватый, другой - красноватый), это значит, что ось осветителя наклонена к вертикальной плоскости микроскопа. Наблюдая через окуляр, перемещают осветитель вручную так, чтобы окраска краев изображения стала одинаковой по всей его окружности. Освещенность поля зрения становится равномерной по всей площади. Остается раскрыть диафрагму осветителя настолько, чтобы ее изображение точно вписалось в поле зрения данного объектива. Световой поток будет при этом использоваться полностью и не возникнет избыточных световых пучков, которые могут породить помехи в изображении. Теперь при помощи реостата, изменяющего питание осветителя, устанавливают такой накал лампы, при котором глаз не утомляется излишней яркостью и без труда различает мельчайшие детали.

Установка освещения по Келеру - обязательное условие квалифицированной работы с микроскопом. Нарушение правильного освещения неизбежно ведет к потере разрешения и контраста, к оптическим ошибкам, особенно при микрофотографии и микрокиносъемке.

К современным микроскопам придаются различные приспособления для автоматической и полуавтоматической установки освещения. Их использование облегчает установку освещения, но не отменяет метода Келера. На базе стандартного освещения по Келеру, проделав некоторые дополнительные операции, налаживают работу всех остальных видов микроскопов. Так, например, для перехода к темнопольной микроскопии нужно после установки стандартного освещения заменить обычный конденсор темнопольным (не меняя положения остальных узлов микроскопа) и, наблюдая в окуляр, медленно поднимать его до тех пор, пока не возникнет темнопольное изображение - сверкающие частицы объекта на почти черном фоне. Предметное стекло для темнопольной микроскопии должно иметь толщину 1 -1,2 мм, иначе конденсором нельзя сфокусировать свет на объекте.

Переход к фазово-контрастной микроскопии несколько сложнее. Конденсор фазово-контрастного устройства имеет в фокальной плоскости барабан с набором кольцевых диафрагм разного размера (см. рис. 2 в ст. «Микроскопия»), Цифры, появляющиеся в окне барабана при его повороте, показывают, каким объективом (х10, х20, х40 или х90) следует пользоваться при диафрагме, величина которой видна в окне в данный момент; цифра О означает отсутствие диафрагмы (работа конденсора в обычном режиме). В этом положении устанавливают стандартное освещение. Затем фокусируют на препарате намеченный к работе объектив.

Изображение, как правило, видно очень плохо, но нужно добиться его фокусировки. Поворотом барабана устанавливают нужную кольцевую диафрагму. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп, имеющийся в комплекте фазово-контрастного устройства. Он облегчает рассмотрение зоны, где формируется изображение.

Перемещая окуляр этого микроскопа, добиваются резкой видимости двух колечек различной плотности, расположенных в глубине тубуса микроскопа. Одно из них образовано кольцевой щелью в диафрагме конденсора; другое представляет собой так называемую фазовую пластинку - полупрозрачное колечко из специального покрытия, нанесенное на одну из линз объектива. Изображения этих колечек, как правило, не совпадают друг с другом. Движением центрирующих винтов, расположенных под барабаном, перемещают диафрагму так, чтобы ее изображение полностью совпало с фазовой пластинкой. После этого заменяют вспомогательный микроскоп обычным окуляром и начинают наблюдение фазово-контрастированного изображения.

Примерно такими же приемами можно получить амплитудное контрастирование в микроскопах амплитудно-контрастного (аноптрального) типа.

После смены препарата следует проверить, сохранились ли условия освещения, так как толщина предметных стекол колеблется и плоскость объекта может не совпасть с ранее установленной плоскостью фокуса конденсора. Для проверки нужно закрыть диафрагму осветителя. Если ее изображение при объективе, сфокусированном на новом препарате, окажется нерезким, нужно изменить высоту конденсора, после чего снова открыть диафрагму до размера поля зрения.

Микроскопирование лучше вести при помощи бинокулярной насадки; она распределяет световую нагрузку на оба глаза, которые в результате меньше утомляются при длительной работе.

Несмотря на значительные успехи микрофотографии и микрокиносъемки за последние годы, рисовальные аппараты остаются весьма полезными при работе с толстыми, многоплановыми объектами, которые невозможно сфотографировать из-за большой глубины. Промышленность выпускает рисовальный аппарат РА-4, пользование которым не вызывает затруднений. Аппаратура для микрофотосъемки (микро-фотонасадка МФН и др.) проста, доступна и удобна в обращении. Однако получение высококачественных микрофотографий требует большой практики.

Окончив работу с микроскопом, нужно прикрыть его от пыли. Если использовали иммерсионный объектив, кедровое масло нужно осторожно стереть чистой ладонью и отмыть его следы с фронтальной линзы объектива чистой тряпочкой, слегка увлажненной бензином или ксилолом (обильно смачивать нельзя, так как эти вещества могут растворить клей, скрепляющий линзы объектива).

Правила ухода за микроскопом описаны в инструкции к нему.

Бактериоскопия - это исследование бактерий при помощи светового микроскопа - широко применяется в медицинской практике. Бактериоскопическому исследованию (см. Бактериологическое исследование) подвергают фиксированные окрашенные препараты, а также бактерии в живом состоянии в препаратах «висячая» или «раздавленная» капли (см. Висячая капля, Раздавленная капля).

Изготовление микроскопических препаратов - см. Бактериологическая техника. Бактериологическое исследование, Вирусологические исследования, Гистологическая техника. К любому микроскопическому препарату предъявляется одно общее требование: толщина предметного стекла не должна превышать 1,2-1,4 мм, покровного - 0,4 мм.

КЛЕТОК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

Цели занятия:

· Изучить устройство светового микроскопа, освоить методику установки света, технику приготовления и микроскопирования временных препаратов.

· Познакомиться со строением клетки, научиться отличать прокариотические клетки от эукариотических.

· Научиться правильно оформлять отчет о лабораторной работе.

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Биология как наука. Методы биологии.
2. Основные концепции биологии.
3. Основные свойства живых систем.
4. Уровни организации живой материи.
5. Современное определение жизни и живого организма.

6. Основные положения современной клеточной теории.

7. Надцарства (империи) и царства живых организмов.

8. Строение прокариотической клетки.

9. Уметь показать на микроскопе механическую, оптическую и осветительную части и рассказать об их устройстве.

10. Какие бывают окуляры; объективы и их фокусное расстояние. Особенности иммерсионного объектива.

11. Что такое увеличение и разрешающая способность микроскопа?

12. Настройка освещения по методу светлого поля.

13. Основные правила работы с оптическим микроскопом.

14. Постоянные и временные микропрепараты. Основные этапы приготовления временных микропрепаратов.

Оборудование и материалы :

1. Микроскоп Микмед -5 или аналог.

2. Предметные и покровные стекла, чашки Петри, стаканчики с водой, глазные пипетки, пинцеты, ножницы, кусочки ваты, иммерсионное масло.

3. Постоянные микропрепараты: фиксированные окрашенные мазки культур сенной палочки и сарцины, крови лягушки.

4. Материалы для приготовления временных препаратов: 2-3 головки репчатого лука.

5. 0,01% раствор метиленовой сини, раствор иода.

РАБОТА 1.1. Изучение устройства светового микроскопа

Световая микроскопия – один из основных методов изучения биологических объектов, поэтому владение техникой микроскопирования необходимо для всех последующих занятий по биологическим наукам, а также для практической деятельности микробиолога.

Рассмотрим конструкцию световых микроскопов на примере микроскопа отечественного производства Микмед - 5. Световой микроскоп состоит из трех основных частей: механической, осветительной, оптической. К механической ч а с т и относятся: штатив, револьверное устройство, макро- и микрометрические винты, предметный столик (рис.1).

Рисунок 1 – Устройство светового микроскопа Микмед -5

1 – окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 – винт крепления насадки; 4 – револьверное устройство; 5 – объективы; 6 – штатив; 7 – предметный столик; 8 – кольцо;
9 – рукоятка механизма грубой фокусировки (кремальера); 10 – рукоятка механизма микрометрической фокусировки; 11 – выключатель; 12 – рукоятка регулирования яркости источника света; 13 – винт крепления конденсора; 14 – конденсор; 15 – основание штатива; 16 – препаратоводитель; 17 – рукоятка перемещения объекта в продольном направлении; 18 – рукоятка перемещения объекта в поперечном направлении; 19 – коллектор в корпусе

Штатив состоит из массивного основания и изогнутого под углом тубусодержателя. Основание имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на рабочем столе.

В верхней части тубусодержателя имеется головка для закрепления бинокулярной насадки и гнездо с винтовой нарезкой для револьвера. Тубус (окулярная трубка) представляет собой полую трубку, в верхнюю часть которой вставляется окуляр.

Револьвер (от лат. revolvo – вращаю) – это вращающийся диск с четырьмя гнездами для ввинчивания объективов.

Винт грубой фокусировки микроскопа – макрометрический винт , или кремальера – расположен с левой стороны штатива. С помощью этого винта предметный столик передвигается в вертикальном направлении вверх и вниз на большое расстояние. Макрометрический винт используется при слабом увеличении, когда объект изучается главным образом в одной плоскости.

Рукоятки микрометрической фокусировки (они - меньшего диаметра)расположены с обеих сторон штатива,используются при сильном увеличении и позволяют при их использовании рассматривать детали объекта, лежащие на разной глубине. Ими следует пользоваться только тогда, когда при помощи кремальеры объект поставлен точно в фокус.

Дополнительная информация

Предметный столик представляет собой четырехугольную пластину с отверстием в центре, над которым помещают предметное стекло с изучаемым объектом. Во избежание смещения, предметное стекло фиксируют специальным прижимом препаратоводителя. Справа под предметным столиком находятся рукоятки механизма координатного перемещения, с помощью которого препарат можно передвигать в поперечном и продольном направлениях.
Осв е т и т е л ь н а я ч а с т ь микроскопа состоит из осветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и съемного светофильтра.
Осветитель встроен в основание штатива. Он включается с помощью выключателя, расположенного на боковой поверхности штатива справа от наблюдателя. Яркость источника света можно изменить, вращая рукоятку регулирования яркости источника света (расположена на штативе справа, под выключателем).
Держатель патрона галогенной лампы прикреплен к основанию штатива двумя винтами снизу, доступ к которым обеспечивается при наклоне прибора. Винты в отжатом состоянии позволяют перемещать держатель патрона с лампой в бобовидных отверстиях основания в случае неравномерного освещения объекта. Если в данном микроскопе источником света является светодиод, то его перемещение при настройке освещения не требуется.

Конденсор находится под предметным столиком, состоит из двух линз, закрепленных в общую оправу, вставлен в кронштейн, который крепится к предметному столику. Для перемещения конденсора служит специальная рукоятка, расположенная слева от наблюдателя. Меняя положение конденсора, можно изменять интенсивность освещения объекта: при опускании освещенность уменьшается, при поднимании – увеличивается.

Ирисовая диафрагма вмонтирована в нижнюю часть конденсора. Она представляет собой кольцо с подвижно укрепленными стальными пластинками, которые могут сдвигаться и раздвигаться с помощью особой ручки; в центре остается отверстие для прохождения светового пучка. Диафрагма позволяет регулировать величину светового потока; максимально суженная, она способствует наибольшей четкости изображения.

О п т и ч е с к а я ч а с т ь микроскопа представлена окулярами и объективами.

Окуляр (от лат. oculus – глаз) помещается в верхней части тубуса и обращен к глазу. Окуляр представляет собой две линзы, заключенные в металлическую гильзу. По числу на верхней плоскости окуляра можно судить о кратности его увеличения (х7, х10, х15). Окуляр можно вынимать из тубуса и заменять по мере необходимости другим.

Объектив – это система линз, укрепленных в общей металлической оправе. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и имеют различную кратность увеличения, которая обозначена числом на их боковой поверхности. Различают объективы малого увеличения (х4 и х10), объектив большого увеличения (х40) и иммерсионный объектив (х100), используемый для изучения наиболее мелких объектов.

Все объективы по способу применения делят на сухие и иммерсионные (от лат. immersio – погружаю или окунаю). У сухих объективов между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух. Воздух и стекло имеют разные показатели преломления света (соответственно 1,0 и 1,52), в результате чего лучи света, переходя из одной среды в другую, преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых объектов (рис.2). У иммерсионных объективов пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено, как правило, кедровым маслом или водой. Предметное стекло, стекло объектива и кедровое масло имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1,515), поэтому лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, рассматриваемые объекты не искажаются. Показатель преломления света, близкий к таковому стекла, имеют и другие вещества, которые используются в качестве иммерсионных составов: касторовое масло (1,48-1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515).

Рисунок 2 – Ход лучей между конденсором и объективом микроскопа

Справа – сухой объектив, слева – иммерсионный. 1 – линза объектива; 2 – верхняя линза конденсора; 3 – предметное стекло; 4 – объект; 5 – покровное стекло; 6 – иммерсионное масло; 7 – воздух. АБ – луч света, проходящий через воздушную среду, отклоняется и не попадает в объектив; ВГ – луч света, проходящий через иммерсионное масло, попадает в объектив.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Эта величина, однако, не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может быть как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Под последней понимают минимальное расстояние между двумя видимыми точками, когда они еще не сливаются в одну, т.е. чем лучше разрешающая способность, тем меньший объект можно увидеть.

Разрешающая способность светового микроскопа определяется в основном дифракцией световых лучей и равна примерно половине длины волны используемого света. Освещая препарат светом с более короткой длиной волны (голубым или синим), можно увидеть более мелкие объекты; при этом разрешающая способность микроскопа близка к 0,2 мкм. С этой целью микроскоп укомплектован синим светофильтром.

ЗАДАНИЕ . Ознакомьтесь с устройством световых микроскопов. Найдите и назовите все их основные части.

РАБОТА 1.2. Приготовление временного препарата.

Настройка освещения

Наилучшие результаты при работе с микроскопом могут быть получены лишь при условии правильного освещения объекта. Вот один из способов установки света на микроскопе Микмед - 5.

1. Для настройки микроскопа приготовьте препарат, который представляет собой два положенных крест-накрест волоса. Для приготовления этого временного препарата отрежьте ножницами часть волоса длиной примерно 3 см, разрежьте его пополам и поместите оба кусочка друг на друга на предметное стекло, сделав перекрест. Затем глазной пипеткой нанесите на волосы каплю воды и накройте покровным стеклом.

Постарайтесь избежать образования пузырьков воздуха под покровным стеклом: возьмите покровное стекло за боковые грани и прикоснитесь его ребром к поверхности капли воды с краю так, чтобы вода растеклась по ребру покровного стекла, затем осторожно опустите (уроните) покровное стекло на предметное. Научитесь брать каплю жидкости такого объема, чтобы она заполнила все пространство под покровным стеклом. Слишком малая капля жидкости не заполнит всего пространства, и оставшийся в виде пузырьков воздух затруднит работу. Взяв слишком большую каплю, вы увидите, что вода выступила за пределы покровного стекла. В этом случае избыток воды нужно удалить полоской фильтровальной бумаги.

Препарат поместите на предметный столик и закрепите его прижимом препаратоводителя. Поставьте место перекреста волос точно в центр светового пучка. Вместо указанного препарата может быть использован любой другой препарат, детали которого хорошо различимы при малом увеличении.

2. Установите в рабочее положение объектив малого увеличения (х4). Когда объектив займет срединное положение над отверстием столика, в револьвере сработает защелка, при этом будет слышен легкий щелчок, и револьвер фиксируется. Поднимите конденсор до упора. При переходе к объективам других увеличений положение конденсора по высоте не менять.

3. Смотря сбоку, с помощью макрометрического винта поднимите предметный столик почти до соприкосновения объекта с с фронтальной линзой объектива. Глядя в окуляр, медленным вращением кремальеры в обратном направлении осторожно опускайте предметный столик до тех пор, пока в поле зрения не появятся очертания объекта. С помощью рукоятки механизма микрометрической фокусировки добейтесь резкого изображения объекта.
4. Выньте окуляр из правой окулярной трубки бинокулярной насадки. Наблюдая в окулярную трубку, раскройте апертурную диафрагму конденсора до размера выходного зрачка объектива.
5. Установите окуляр в окулярную трубку, наблюдайте поле зрения окуляра. При неравномерно освещенном поле зрения отцентрируйте лампу, как указано в руководстве по эксплуатации. Для достижения наилучшего качества изображения рекомендуется для каждого объектива прикрывать апертурную диафрагму конденсора на 1/3 выходного зрачка объектива, а также использовать синий светофильтр.
Нормальная работа осветительной системы обеспечивается только при использовании предметных стекол толщиной 1 – 2 мм.

ЗАДАНИЕ . Приготовьте микропрепарат и настройте освещение, как указано выше.

Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.

Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение.

Различают полезное и бесполезное увеличения . Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа, увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур.

В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы , на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологический исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопический). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп (МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз.

В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую. К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).

Устройство световых микроскопов изображено на рис. 1.

Рис. 1. Устройство световых микроскопов:

А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ.

1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 - микрометренный винт, 6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 - объектив, 12 - корпус коллекторной линзы, 13 - патрон с лампой, 14 - источник электропитания.

Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40. Качество объектива определяет его разрешающая способность.

Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно . Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом.

Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.

Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света.

Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало.

Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки.

Конденсор состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект.

Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света.

Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости.

Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика.

Подставка - это основание микроскопа.

Коробка с микрометренным механизмом , построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота .

Тубус или трубка - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять.

Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера.

Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении.

Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат.

Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.

Задание 1:

внимательно прочитайте содержание работы № 2;

законспектируйте технику микроскопирования и правила работы с микроскопом в рабочую тетрадь.

Установить микроскоп у края стола против левого плеча. С правой стороны расположить открытый альбом для практических занятий. Протереть окуляр марлевой салфеткой. Обратить зеркало микроскопа вогнутой стороной к источнику света.

Привести микроскоп в рабочее состояние:

установить объектив малого увеличения на расстоянии 1-1,5 см от предметного столика;

поднять конденсор до предела;

смотря в окуляр одним глазом, не закрывая другого, равномерно и интенсивно осветить зеркалом поле зрения;

Поместить препарат на предметный столик микроскопа покровным стеклом кверху (обратить на это внимание). Передвигать препарат большим и указательным пальцами за ребро с тем, чтобы найти место, подлежащее изучению; средний палец должен упираться в предметный столик.

Опустить конденсор до положения, обеспечивающего наилучшее освещение препарата на малом увеличении.

Рассмотреть препарат с помощью 8- или 10-кратного объектива (малого увеличения). Найти место, подходящее для изучения при большом увеличении, поставить его в центр поля зрения и отрегулировать резкость изображения микровинтом.

При переходе с малого увеличения на большое необходимо, не меняя фокусного расстояния, повернуть револьверную пластинку объективов до щелчка, чтобы в рабочее положение встал 40-кратный объектив (большого увеличения). Микровинтом добиться резкого изображения. Работа макровинтом на большом увеличении запрещается, так как легко можно раздавить препарат.

Левая рука должна находиться на микрометрическом винте, слегка поворачивая его в обе стороны для просматривания деталей среза, лежащих на разной глубине поверхности среза.

Уяснив пространственное положение, пропорции и взаимоотношения деталей изучаемого объекта, приступить к зарисовке.

Запрещается снимать препарат из под объектива большого увеличения. Для того, чтобы убрать препарат с предметного столика микроскопа в рабочее положение ставится объектив малого увеличения и препарат снимается с предметного столика микроскопа.

Запрещается развинчивать какие-либо части микроскопа. В случае неисправности микроскопа обращаться к преподавателю .

Задание 2:

подготовьте микроскоп к работе, по вышеизложенным правилам работы с микроскопом под пунктами 1-2;

получите микропрепарат (любой) у преподавателя;

получите резкое изображение сначала на малом, а затем на большом увеличении микроскопа согласно пунктам 3-7 правил работы с микроскопом;

рассмотрев микропрепарат, правильно снимите его с микроскопа, согласно пункту 9 правил работы с микроскопом.

РАБОТА № 3. ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВРЕМЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Задание 1:

внимательно прочитайте содержание работы № 3;

приготовьте временный препарат.

Возьмите предметное стекло из чашки Петри, держа его за боковые грани, и положите на стол. Отделите от кусочка луковицы мясистую чешуйку. На внутренней ее стороне находится тонкая пленка. Снимите ее пинцетом и отрежьте кусочек пленки размером несколько квадратных миллиметров. Положите этот кусочек на предметное стекло, наберите пипеткой раствор йода, капните каплю йода на пленку и накройте покровным стеклом (обязательно держа его за боковые грани, чтобы не оставить следов от пальцев).

Задание 2:

ознакомьтесь с нижеизложенным описанием микроскопической картины временного препарата;

получите изображение временного препарата на малом увеличении и рассмотрите его;

получите изображение временного препарата на большом увеличении и рассмотрите его.

Рассмотрите препарат на малом увеличении. На препарате видна группа клеток, имеющих вытянутую, почти прямоугольную форму. Крупные округло-овальные ядра в клетках окрашены йодом в желто-коричневый цвет. Переведите объектив на большое увеличение и найдите двухконтурную оболочку клетки. Обратите внимание на её толщину. При внимательном рассмотрении цитоплазмы клетки видна ее зернистая структура. Ядро обычно занимает срединное положение в клетке. Иногда оно смещено к оболочке и приобретает сплющенную форму. В ядре можно заметить 1-2 ядрышка. Неокрашенные пустоты в цитоплазме клеток представляют собой вакуоли.

Задание 3:

в рабочей тетради выполните зарисовку микроскопической картины временного препарата клеток кожицы лука, предварительно ознакомившись с образцом зарисовки и содержанием работы № 4.

Зарисуйте несколько клеток. На рисунке должны быть обозначены: 1) ядро 2) цитоплазма; 3) двухконтурная оболочка.

ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ЗАРИСОВКИ:

Препарат: Кожица лука.

Окраска: спиртовый раствор йода.

РАБОТА № 4 . ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ.

Задание 1:

внимательно прочитайте правила оформления протокола практического занятия;

законспектируйте правила оформления протокола практического занятия в рабочей тетради.

На практических занятиях необходимо иметь при себе тетрадь, ручку, карандаш простой, карандаши цветные, линейку, ластик.

В тетрадях для практических занятий студент записывает дату проведения занятия. Затем, следуя методическим указаниям, записывает номер и тему занятия, далее – номер работы, название работы и последовательно выполняет все задания к каждой работе.

При выполнении зарисовок следует выполнять следующие правила :

На практическом занятии при исследовании препарата студент в поле зрения наблюдает определенную микроскопическую картину. Результаты микроскопического исследования препарата обязательно документируются. Это может быть выполнено путем микрофотографирования или зарисовки микроскопического изображения (поля зрения, либо его части). Зарисовка является обязательным профессиональным практическим навыком студента. Правильный рисунок микроскопического изображения, выполненный в результате работы с препаратом, является единственным свидетельством освоения материала на практическом занятии.

До начала зарисовки вверху страницы пишется название номер и название работы, ниже - название препарата. При изучении простейших, гельминтов, насекомых указывается систематическое положение объекта в соответствии с международной номенклатурой, при этом обозначение типа, подтипа, класса пишется на отдельной строке по-русски и по-латыни.

Требование к рисунку:

рисунок располагается в левой части листа;

рисунок выполняется аккуратно, крупно, простым или цветным карандашами, с хорошо различимыми деталями;

на одной странице размещается не более 2 рисунков;

рисунок должен правильно отображать форму, соотношения объема и размеров (длина, ширина и др.) отдельных частей и целого объекта;

контур поля зрения микроскопа вокруг рисунка не зарисовывается.

К каждому рисунку должны быть сделаны обозначения его отдельных частей.

Требования к обозначениям:

к отдельным частям простым карандашом ставят стрелочку и против каждой пишут определенную цифру;

справа от рисунка сбоку от рисунка столбиком по вертикали располагают арабские цифры, против цифр – названия.

Оформленная практическая работа в конце занятия представляется для проверки ведущему преподавателю. При отсутствии замечаний по форме и содержанию работы преподаватель расписывается в тетради.